Диаграмма яблонского объяснение на примере пи связей. Введение в флуоресценцию

30.10.2023

Электронная спектроскопия

в супрамолекулярной химии

Основные разделы:

Физические основы поглощения света и фотолюминесценции

Техника измерения электронных спектров поглощения и люминесценции

Современные методы обработки спектроскопических данных

Примеры применения электронной спектроскопии для исследования свойств супрамолекулярных систем

Экспериментальные методы химии высоких энергий: Учебное пособие / Под общ. ред. М. Я. Мельникова. – М.: Изд-во МГУ, 2009. – 824 с

(ISBN 978-5-211-05561-2).

Е.Н. Ушаков / Самосборка и фотохимия супрамолекулярных систем на основе краунсодержащих непредельных соединений // дисс. док. хим. наук, ИПХФ РАН, Черноголовка, 2006. – 263 с.

[email protected] )

Дополнительная литература:

E.N. Ushakov et al , Sandwich-type complexes of alkaline-earth metal cations with a bisstyryl dye containing two crown ether units, J. Phys. Chem. A, 1999, vol. 103, p. 11188-11193.

(имеется в электронном виде, PDF-файл, [email protected] )

I. Физические основы поглощения света и фотолюминесценции

Взаимодействие света с веществом

Свет, как известно, характеризуется длиной волны  и частотой  , которые связаны соотношением

где с – скорость света в вакууме, n – показатель преломления среды.

Волновую теорию света используют для интерпретации таких явлений как отражение, преломление, дифракция света, т.е. явлений, при которых свет не поглощается средой.

Однако для описания поглощения и испускания света веществом необходимо использовать квантовую теорию, согласно которой световая энергия может поглощаться только определенными порциями, или квантами. Энергия, переносимая одним квантом света, или, другими словами, фотоном, определяется уравнением Планка:

где h – постоянная Планка. То есть, монохроматический свет характеризуется не только длиной волны, но также и энергией фотона.

Поглощение монохроматического света гомогенной средой, содержащей поглощающее свет вещество, подчиняется закону ЛамбертаБера:

где I 0 – энергия монохроматического света, падающего за единицу времени на поверхность слоя вещества; I – энергия, прошедшая через слой вещества за единицу времени; l – толщина слоя, см; C – концентрация поглощающего свет вещества, моль/л;  – молярный коэффициент поглощения (экстинкция), л/(мольсм), который зависит от природы вещества, длины волны света и температуры.

В фотохимии для характеристики поглощения обычно используют понятие оптическая плотность раствора (D , безразмерная величина)

Закон ЛамбертаБера не выполняется в тех случаях, когда значительная доля молекул переходит в возбужденное состояние (например, при очень высокой интенсивности падающего света). Отклонения от закона ЛамбертаБера иногда наблюдаются и при низких интенсивностях света. Однако эти отклонения являются кажущимися; как правило, они связаны либо с недостаточной разрешающей способностью спектрометра, либо с такими явлениями как ассоциация молекул.

Возбужденные электронные состояния

Используя слово свет, мы обычно подразумеваем оптическое излучение, видимое человеческим глазом. Спектральная кривая чувствительности человеческого глаза лежит в диапазоне 400 £ l £ 750 нм. Максимум чувствительности находится около 555 нм (зеленый свет). Для фотохимии интерес представляет более широкая область излучения, которую формально можно разделить следующим образом:

ближнее ультрафиолетовое (200 £ l £ 400 нм )

видимое (400 £ l £ 750 нм)

ближнее инфракрасное излучение (750 £ l £ 1000 нм)

При поглощении кванта света с l = 200–1000 нм возбуждаются внешние электроны молекулы, осуществляющие химическую связь; их возбуждение может приводить к химическому превращению. Этот спектральный диапазон является основным для спектроскопии поглощения и испускания света.

Спектры поглощения

Спектр поглощения вещества обычно состоит из полос разной интенсивности и ширины. Происхождение этих полос можно проиллюстрировать с помощью энергетической диаграммы молекулярных орбиталей (МО). Электроны в молекуле в основном состоянии располагаются парами на МО с разной энергией. Длинноволновая полоса в электронном спектре поглощения обычно соответствует переходу электрона с верхней занятой МО (ВЗМО) на нижнюю вакантную МО (НВМО). Полосы поглощения с большей энергией соответствуют переходам на вышележащие вакантные МО (например, S 0 S 2) или переходам с нижележащих занятых МО (например, S –1 S 1).

Структура и форма полосы поглощения

Полосы в спектрах поглощения нередко имеют определенную структуру. Это связано с тем, что каждому электронному состоянию соответствует набор разных колебательных состояний.

На рисунке показана зависимость потенциальной энергии двухатомной молекулы в основном электронном состоянии от межъядерного расстояния (кривая S 0 ).

Максимумы на кривых для колебательных состояний ( = 0, 1, 2, 3, 4) отвечают наиболее вероятным межъядерным расстояниям. Для нулевого колебательного состояния  = 0 наиболее вероятное межъядерное расстояние находится в области минимума кривой потенциальной энергии. Для более высоких колебательных уровней наиболее вероятные межъядерные расстояния находятся вблизи точки поворота колебания.

Принцип Франка  Кондона

Для объяснения относительной интенсивности переходов между колебательными уровнями основного и возбужденного электронных состояний используют принцип ФранкаКондона. Этот принцип основан на том, что электронный переход является намного более быстрым процессом (~10  15 с), чем движение ядер в молекуле (~10  13 с), то есть за время электронного перехода взаимное расположение ядер и их импульсы практически не изменяются. Поэтому электронно-колебательные переходы можно представить вертикальными линиями, соединяющими поверхности потенциальной энергии основного S 0 и возбужденного S 1 электронных состояний.

Большинство молекул при комнатной температуре находится на нулевом колебательном уровне, поэтому фотоиндуцированные электронные переходы происходят именно с этого уровня.

При данном расположении потенциальных кривых S 0 и S 1 наиболее вероятным электронно-колебательным переходом будет (0  2 )-переход. Интенсивность (0  0 )-перехода сравнительно мала, поскольку этому переходу соответствует маловероятное межъядерное расстояние.

В многоатомной молекуле кривая потенциальной энергии переходит в многомерную поверхность, поэтому одному электронному переходу соответствует множество колебательных переходов. Часто эти колебательные переходы близки по энергии и им соответствует одна общая широкая полоса поглощения. Форма этой полосы, тем не менее, определяется принципом Франка-Кондона.

Процессы релаксации в электронно-возбужденных состояниях.

В жидких растворах при комнатной температуре электронно-возбужденные состояния молекул подвергаются сравнительно быстрым процессам релаксации электронно-колебательной энергии. Основные процессы релаксации: внутренняя конверсия из верхних возбужденных состояний S n в нижнее возбужденное состояние S 1 (< 10  12 с) и колебательная релаксация в состоянии S 1 , т.е. диссипация избыточной энергии колебаний в среде за счет столкновений возбужденных молекул вещества с молекулами среды (~10  11 с).

Эти процессы, как правило, происходят существенно быстрее по сравнению с процессом спонтанного испускания фотона, т.е. излучательной дезактивацией возбужденного состояния S 1 (~10  9 с). Поэтому излучательный переход из состояния S 1 в основное состояние S 0 , называемый флуоресценцией , происходит, как правило, из нулевого колебательного состояния.

Таким образом, общим переходом при поглощении и испускании света является переход между нулевыми колебательными уровнями основного и возбужденного состояний, который называют (0  0 )-переходом. Энергия (0  0 )-перехода  наименьшая при поглощении и наибольшая при испускании.

Состояния S 0 и S 1 обычно имеют аналогичные распределения колебательных уровней по энергиям, поэтому спектр флуоресценции, как правило, близок к зеркальному отражению спектра поглощения, если оба спектра представлены в шкале энергии фотона.

Стоксов сдвиг

Для сложных молекул в жидкой фазе (0  0 )-переход в спектре флуоресценции имеет меньшую энергию, чем (0  0 )-переход в спектре поглощения. Это связано с тем, что сразу после поглощения или испускания фотона молекула оказывается в неравновесном состоянии сольватации. В невязких растворителях при комнатной температуре переход возбужденного флуорофора в равновесное состояние сольватации происходит до испускания фотона. Поэтому (0  0 )-переход при испускании света имеет меньшую частоту, чем (0  0 )-переход при поглощении. Смещение полосы флуоресценции в красную область относительно длинноволновой полосы поглощения называется стоксовым сдвигом .

Мультиплетность

Мультиплетность электронного состояния равна n + 1, где n – число неспаренных электронов. Молекулярные орбитали молекул с четным числом электронов заполнены парами электронов с противоположно направленными спинами. Мультиплетность основного состояния большинства молекул с четным числом электронов равна 1, т.е. это синглетные состояния . При переходе электрона на верхнюю орбиталь его спин может оказаться ориентированным в том же или в противоположном направлении относительно оставшегося на нижней орбитали электрона. Если ориентации спина сохраняется, то мультиплетность возбужденного состояния, как и основного состояния, будет синглетным. Если же возбуждаемый электрон меняет направление спина, возбужденное состояние будет триплетным . Таким образом, одному основному состоянию соответствуют разные возбужденные состояния – синглетные и триплетные.

Диаграмма Яблонского

Физические процессы, протекающие в электронно-возбужденном состоянии молекул, принято представлять в виде диаграммы Яблонского. Основными безызлучательными процессами дезактивации нижнего возбужденного состояния S 1 являются внутренняя конверсия (переход между состояниями одинаковой мультиплетности) и интеркомбинационная конверсия (переход между состояниями разной мультиплетности, например, синглет-триплетный переход S 1  T 1 ). Внутренняя конверсия S 1 S 0 – сравнительно медленный процесс. Поэтому в возбужденном состоянии S 1 могут наблюдаться процессы спонтанного испускания фотона (спонтанное излучение) и фотохимические реакции. Излучательными процессами являются разрешенная по спину флуоресценция и запрещенная по спину фосфоресценция.

Классификация электронных переходов

Электронные спектры поглощения в УФ и видимом диапазонах, дают важную информацию о структуре и свойствах электронно-возбужденных состояний молекул. Знание спектра поглощения вещества является обязательным условием фотолюминесцентных и фотохимических исследований. Кратко остановимся на классификации электронных переходов

Электроны в органической молекуле располагаются на молекулярных -, - и n -орбиталях. На каждой молекулярной орбитали помещаются два электрона, отличающихся спинами. При возбуждении молекулы светом происходит переход электрона с занятой связывающей орбитали на свободную разрыхляющую орбиталь. Такие переходы обозначают в соответствии с их орбитальной природой: *, n *, * и n *.

Полосы поглощения, обусловленные переходами  * , находятся преимущественно в вакуумной УФ области < 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Переходам n  * соответствуют полосы поглощения в УФ области. Например, органические соединения, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталяхгетероатомов, О, N, S, поглощают УФ свет в области около 200 нм.

П ереходам  * и n  * соответствуют полосы поглощения в средней УФ-области. При сопряжении кратных связей полосы, обусловленные этими переходами, смещаются в ближнюю УФ- и видимую область спектра. Переходы n * характерны для соединений, содержащих такие хромофорные группы, как С=О, C=S, N=N; эти переходы часто оказываются запрещенными, и соответствующие им полосы поглощения имеют сравнительно низкую интенсивность.

Эта классификация пригодна в основном для относительно простых молекул. В сложных молекулах определенный вклад в электронный переход могут вносить электроны, находящиеся на орбиталях разного типа.

Значительный интерес представляют электронные переходы с переносом заряда. Если в молекуле имеются электронодонорная и акцепторная группы, и они находятся в -электронном сопряжении, то переход S 0 S 1 может сопровождаться переносом заряда от донора к акцептору по цепи сопряжения, как например, в данном стириловом красителе:

В этом случае говорят об электронном переходе с внутренним переносом заряда . Соответствующие полосы поглощения обычно характеризуются высокой интенсивностью и располагаются в видимой, а иногда и в ближней ИК области.

Для слабосвязанных органических донорно-акцепторных комплексов могут наблюдаться полосы поглощения, относящиеся к электронному переходу с переносом заряда от донора к акцептору через пространство (межмолекулярный перенос заряда ). Такие комплексы часто называют комплексами с переносом заряда. Длинноволновые полосы поглощения таких комплексов имеют сравнительно низкую интенсивность и могут находиться в ближней УФ, видимой и ближней ИК области спектра.

В металлорганической химии различают полосы поглощения, соответствующие переносу заряда от лиганда к металлу (ПЗЛМ ) и от металла к лиганду (ПЗМЛ ).

Эта работа заняла первое место в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса « »-2014.

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы . С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться. Пока наметились лишь некоторые перспективы в этом направлении в связи с изучением темной материи и темной энергии . А вот свет человечество давно и успешно изучает и использует, в том числе в качестве исследовательского «инструмента». Одно из направлений использования света в экспериментальных исследованиях связано с явлением флуоресценции. За последние тридцать лет использование различных методов, основанных на регистрации флуоресценции, в биологических и медицинских исследованиях стремительно возросло. Обусловлено это появлением как новых технических возможностей - в первую очередь компьютеров и лазеров, - так и широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов. Словно микроскопические репортеры эти соединения сообщают нам особыми световыми сигналами о свойствах молекулярного мира, в котором они находятся. Флуоресцентная методология обеспечила решение многих принципиальных задач биологии и медицины. Благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности она вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так и в прикладных работах в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике и многих других областях. Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию можно получить с их помощью из глубин микромира? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего - что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом, диапазоне. Впервые это явление было описано как видимое изменение цвета растворов некоторых органических соединений и минералов при наблюдении не на просвет (в проходящем свете), а под углом к проходящему свету. Так, например, Дэвид Брюстер (Sir David Brewster) в 1833 году заметил, что при освещении белым светом зеленого спиртового раствора хлорофилла от него «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, Джон Хершель (Sir John Herschel) описал подобные наблюдения - появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году Джордж Стокс (George Gabriel Stokes) обнаружил видимое на глаз свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. Учитывая источник происхождения наблюдавшегося свечения, он назвал это явление флуор есценцией, как он отметил, по аналогии с термином опал есценция, описывающим явление дихроизма в опале. Важно отметить, что эти термины не только отражают «историю» своего происхождения, но, что более важно, обозначают разные физические явления. Флуоресценция - это излучение , возникающее в молекулах вещества под влияние света. Опалесценция - это рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией.

По своей сущности флуоресценция является одной из разновидностей люминесценции . Этим термином описывают все явления излучения веществом, вызванного «возбуждением» молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хеми люминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют био люминесценцией*. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электро люминесценция), быстрыми электронами (катодо люминесценция), γ-излучением (радио люминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фото люминесценции.

* - Недавно на «биомолекуле» вышла замечательная статья, описывающая открытие нового типа биолюминесценции: « » . - Ред.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами или флуорохромами . Обычно этими терминами пользуются как синонимами. Однако в ряде источников под флуорохромами понимают все виды флуоресцирующих молекул, а под флуорофорами - только флуоресцирующий компонент (группировку) крупной молекулы. В классической монографии Дж. Р. Лаковица используется только один термин - флуорофор, для всех типов флуоресцирующих веществ. С целью единообразия мы будем пользоваться этим термином. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой , а свободный флуорофор - зондом . Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют флуоресцентными красителями . Наконец, некоторые авторы стали использовать термин биосенсоры в отношение флуорофоров, используемых в биологических исследованиях.

Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году, и которая носит его имя. На рисунке 1 представлена упрощенная форма этой диаграммы.

Рисунок 1. Диаграмма Яблонского , иллюстрирующая электронные процессы в молекулах-флуорофорах при поглощении квантов света. Горизонтальные линии - энергетические уровни электронов: S 0 - основное, невозбужденное состояние; S 1 - синглетное возбужденное состояние; 0–3 - квантованные подуровни; Т 1 , Т 2 - квантованные уровни триплетного возбужденного состояния. Стрелками показаны переходы электронов в разные энергетические состояния: П - поглощение света, Фл , Фосф - испускание флуоресценции и фосфоресценции, соответственно, ВК - внутренняя конверсия, ИК - интеркомбинационная конверсия, ВР - вибрационная релаксация.

При поглощении фотонов определенной энергии в молекуле флуорофора происходит переход электронов из «основного» (S 0) на один из подуровней «возбужденного» (S 1 , S 2 , ..., S n) состояния с более высокой энергией. Спин электрона при переходе не меняется, и поэтому эти уровни называют синглетными. «Возбужденное» состояние нестабильно, и электроны быстро возвращается на исходный энергетический уровень. Происходить это может несколькими путями. Три из них - безызлучательные квантовые переходы: внутренняя конверсия, интеркомбинационная конверсия и вибрационная релаксация . Два других сопровождаются излучением света - это флуоресценция и фосфоресценция . При внутренней конверсии энергия электрона уменьшается до минимального синглетного уровня. В ходе вибрационной релаксации, которая вызвана преимущественно взаимодействием с окружающими молекулами, поглощенная энергия может «рассеяться» в виде тепла до «основного» уровня. Интеркомбинационная конверсия приводит к уменьшению энергии электронов с изменением спина. Такое энергетическое состояние электрона называется триплетным. Флуоресценция возникает при переходе с нижнего синглетного уровня в «основное» состояние, а фосфоресценция - при переходе в «основное» состояние с триплетного уровня.

Отметим три важных обстоятельства.

Во-первых, вероятности вышеотмеченных переходов различаются. Представление об этом дает сравнение времени, за которое осуществляется каждый из этих переходов, иными словами, время пребывания электронов в каждом из этих состояний (таблица 1). Чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция - маловероятные процессы. Это проявляется в сравнительно слабом свечении большинства флуорофоров даже при интенсивном облучении.
Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в «основное» состояние только с самого низкого синглетного уровня, то энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения.
И, наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в вышеуказанных процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером , который «на языке» флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения.

«Язык» флуоресцентных репортеров

Флуоресценция характеризуется рядом параметров, которые меняются в зависимости от физического окружения или химической модификации флуорофора. Эти параметры и являются тем «языком», на котором передается информация от флуоресцентного репортера. Если продолжить аналогию, то сами параметры подобно словам приобретают конкретный смысл только при определенной их комбинации и в контексте. «Контекстом» для параметров флуоресценции являются условия их регистрации. Флуоресценция всех флуорофоров имеет пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

Каждый флуорофор имеет индивидуальные спектры поглощения и флуоресценции . Для иллюстрации на рисунке 2 представлены спектры Lyso Tracker TM Blue (Molecular Probes ®) и флуоресцеина. Основными параметрами спектров являются интенсивность флуоресценции, положение максимумов и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Часто именно эти параметры «информируют» об определенных свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при разных рН среды. На рисунке 2 в качестве примера показана рН-зависимость спектра флуоресценции Lyso Sensor TM Yellow/Blue (Molecular Probes ®). Если такие изменения специфические, т.е. могут быть вызваны только сдвигами рН, то данный флуорофор может быть рН-репортером. Lyso Sensor TM Yellow/Blue является одним из таких репортеров.

Квантовый выход флуоресценции - это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно квантовый выход определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Часто этот показатель является решающим при выборе флуорофора на роль флуоресцентного репортера. Например, флуоресцеин имеет квантовый выход около 0.9, что и обеспечивает его широкое использование как в роли самостоятельного зонда, так и в качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к различным физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции - это усредненное время, в течение которого молекулы флоурофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов флуоресценции. Измеряется этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень «чувствительно» к физико-химической «обстановке», в которой находится флуоресцентный репортер. С другой стороны, этот показатель является специфической характеристикой флуорофора, что позволяет получать «репортажи» от него в присутствии других флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками.

Анизотропия флуоресценции - это количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Пять вышеуказанных параметров флуоресценции являются непосредственно измеряемыми характеристиками излучения, которое «передают» репортеры. Однако информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. С флуоресценцией связан ряд явлений, которые используются в качестве методических «ухищрений» для получения той или иной информации от флуоресцентных репортеров.

Так, например, существует явление безызлучательной (резонансной) передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, а у акцептора возрастает. Происходить это может между флуорофорами с определенными спектральными свойствами и, что особенно важно, если они находятся на достаточно близком расстоянии. БПЭ лежит в основе многих методических подходов, позволяющих выявлять взаимодействие молекул. Определение эффективности безызлучательной передачи энергии позволяет даже оценивать расстояние между молекулами. В связи с этим БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой» (см.: « » ).

Ряд методических возможностей базируется на тушении флуоресценции. Тушение может быть вызвано физическим взаимодействием флуорофора с молекулами-тушителями - такими, как кислород, галогены, амины, а также некоторые «электрон-дефицитные» органическими молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер может «сообщать» о присутствии в его окружении определенных «тушителей».

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. В большинстве случаев с точки зрения регистрации флуоресценции это негативное явление. Однако «в умелых руках» это явление используется как специальный методический прием. Широкое распространение в изучении вязкости и/или диффузионных свойств цитоплазмы клеток получила методика восстановления флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания. Сущность ее заключается в том, что в небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, производится его обесцвечивание кратковременной мощной вспышкой лазера. Затем регистрируется восстановление флуоресценции в том же участке, что обусловлено диффундирующими из других областей клетки не обесцвеченными молекулами флуорофора. По динамике этого процесса и характеризуют диффузионные свойства цитоплазмы.

Флуоресцентные репортеры, какие они?

Способностью флуоресцировать обладают многие вещества с определенными конфигурациями электронов. Такие конфигурации складываются в некоторых атомах, молекулах и надмолекулярных комплексах. Однако требуются специальные исследования для выявления потенциальной «способности» флуорофора выступать в роли молекулярного репортера для биологических и медицинских исследований. «Способности» эти оцениваются по специфичности информации, которую они передают, их стабильности, в первую очередь фотостабильности, в ряде случаев учитывается токсичность для отдельных клеток или организма. Особенностью флуоресцентных «корреспондентов» является их высокая индивидуальная «специализация». «Специализация» каждого репортера характеризуется по взаимодействию с определенными компонентами биологической системы, а также по специфичности флуоресцентных сигналов. Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические молекулы-флуорофоры представляют наиболее многочисленную и разнообразную группу флуоресцентных репортеров. Как велико это разнообразие, можно оценить, заглянув в каталог фирмы Molecular Probes , специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. Это уже одиннадцатое издание (обновление) каталога (на момент написания статьи), что свидетельствует о высоких темпах развития данной области.

Большое разнообразие органических флуоресцентных репортеров обусловлено широким спектром задач и условий их применения. При выборе или при разработке репортеров принимаются во внимание информация, которую нужно получить, спектральные свойства флуорофора, а также специальные условия, связанные с особенностями исследуемой системы. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и, соответственно, яркую флуоресценцию. Он может выступать в роли репортера рН. Однако, например, для измерения рН внутри клеток он не подходит, т.к. не проникает через цитоплазматическую мембрану. Его «доставка» в клетки может быть осуществлена с использованием гидрофобного производного - флуоресцеиндиацетата, который утратил способность флуоресцировать, но может проникать через гидрофобный барьер цитоплазматической мембраны. В клетках эстеразы отщепляют ацетильные группировки, и флуоресцеин оказывается в клетках. Аналогичным образом доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, т.е. через эстерифицированное производное. Этот репортер служит для регистрации наличия в клетках активных форм кислорода. Введение изотиоцианата в молекулу флуоресцеина дает возможность присоединять флуорохром к аминогруппам не флуоресцирующих молекул. С использованием флуоресцеинизотиоцианата создаются высокоспецифичные флуоресцирующие белковые репортеры - различные антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) представляет собой не флуоресцирующее производное, которое может превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм. Это пример фотоактивируемых флуорофоров, флуоресцентные свойства которых как бы «спрятаны» (англ. «caged») до облучения.

Рисунок 4. Структурные формулы флуоресцеина и некоторых его производных.

В семидесятых годах ХХ века сотрудник Принстонского университета (США) Осаму Симомура (Osamu Shimomura ) при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria выделил два белка, участвующих в этом процессе. Он установил, что при взаимодействии ионов кальция с одним из выделенных белков возникает хемилюминесценция голубого цвета. При этом второй белок может поглощать голубой свет и флуоресцировать зеленым светом, что придает зеленоватый оттенок свечения медузы. Первый белок был назван экворином, второй зеленым флуоресцентным белком (ЗФБ). С этого момента начинается история одной из самых успешных разработок молекулярной биологии, а ее основные герои - Осаму Симомура, Мартин Чалфи (Martin Chalfie ) и Роджер Тсьен (Roger Tsien ) в 2008 году были удостоены Нобелевской премии в области химии за открытие и подробное изучение ЗФБ . Чем же так замечателен этот белок?

После открытия ЗФБ начались интенсивные исследования его структуры, был синтезирован и клонирован соответствующий ему ген. Кроме того у некоторых морских беспозвоночных (Hydrozoa и Anthozoa ) были обнаружены аналогичные флуоресцирующие белки, структура которых также была охарактеризована. Все это позволило с помощью методов молекулярной биологии целенаправленно конструировать гены, кодирующие модифицированные формы ЗФБ с широким диапазоном спектральных характеристик, а также такие фоторегулируемые варианты, свечение которых можно «включать и выключать» путем облучения ультрафиолетовым излучением. В настоящее время можно говорить о том, что на основе ЗФБ создана и продолжает увеличиваться целая «армия» разнообразных флуоресцентных белков (ФБ) . Возможность применения ФБ показана в исследованиях многих видов клеток от бактерий до млекопитающих.

Несколько «скромнее» по сравнению с ЗФБ пока выглядит «судьба» экворина. Его структура также была установлена, и синтезирована ДНК, кодирующая этот белок. Изучение зависимости хемилюминесценции экворина от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации катиона в некоторых клетках. Для измерения содержания ионов кальция внутри клеток существуют и флуоресцентные репортеры, в том числе производные ФБ. Однако достоинством хемилюминесцентного метода с использованием экворина является отсутствие необходимости возбуждающего флуоресценцию облучения, которое не всегда является безвредным для биологической системы, да и для флуорофоров, свечение которых при длительном облучении ослабляется (эффект фотообесцвечивания). Экворин относят к сравнительно большой группе так называемых люциферинов - веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Изучение люциферинов представляет интерес не только с целью их практического применения. Ведь до сих пор не известно, зачем биологических объектам вообще нужна биолюминесценция.

В последние годы заметно возрос интерес к созданию флуоресцентных репортеров на основе неорганических флуорофоров путем формирования так называемых биоконъюгатов, т.е. их комплексов с некоторыми органическими соединениями и/или с биологическими молекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее их ионы, например, Tb 3+ и Eu 3), кластеры из нескольких атомов золота и серебра после образования таких комплексов приобретают способность к сенсибилизированной флуоресценции. Сущность явления заключается в том, что энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важным свойством этого процесса является то, что молекулы-доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе является «замедленным» по сравнению с «обычной» флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. табл. 1). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Сенсибилизированная флуоресценция репортеров-биоконъюгатов делает их «полезными» с точки зрения техники регистрации излучения. Так, в частности, они используются в условиях, когда в исследуемой системе имеется «обычная» флуоресценция других компонентов в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек * (англ. quantum dots ). Квантовые точки, как правило, состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Вследствие малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего 10–50 атомов!) для их электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами»). Причем энергия этих переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции, зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, т.е. меньше длина волны флуоресценции (рис. 5). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек, имеющих практически любую спектральную конфигурацию. К этому следует добавить, что они, по сравнению с органическими флуорофорами, обладают еще и более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 6 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

* - Кого заинтриговало это название, прочтите подробную статью « » . - Ред.

Рисунок 5. Флуоресценция коллоидных растворов квантовых точек разного размера.

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), покрытого слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющего «защитную» функцию, и лиганда - какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул.

Рисунок 6. Относительные размеры флуоресцентных репортеров. Для сравнения показан также белок иммуноглобулин G (Ig G).

Биоорганическая оболочка биоконъюгата обеспечивает его стабильность как коллоидной частицы и формирует «задание» репортера, его целевое назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую «собрать и передать» информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (на рис. 6 показаны приблизительные размеры квантовых точек без «снаряжения» биоконъюгата). В биоорганическую оболочку могут быть включены низкомолекулярные соединения - такие как биотин - и высокомолекулярные: одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды) и белки, в том числе ферменты и антитела (Ig G).

Инструменты для «чтения» флуоресцентных репортажей

В списке инструментов для получения и анализа «сообщений» флуоресцентных репортеров исторически первым является наш глаз. С его помощью можно проводить визуальные наблюдения флуоресцентного свечения на макроскопических объектах непосредственно, а на микроскопических - с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примером макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы ФБ, хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. А в «обычный» флуоресцентный микроскоп (о «необычных» микроскопах чуть дальше) чаще всего заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, а также в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток. Однако возможности зрительного анализа существенно ограничены в основном качественной оценкой «сигналов» флуоресцентных репортеров: «есть свечение -нет свечения» в определенной области образца. Гораздо больше информации можно получить, если «читать и расшифровывать» флуоресцентные «репортажи» по количественным характеристикам свечения (см. раздел «Язык» флуоресцентных репортеров ).

Для количественной характеристики флуоресценции необходимы измерения с использованием специальных приборов и определенной методологии. Условно можно выделить две методологии измерений параметров флуоресценции. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение интегральных (усредненных ) характеристик флуоресценции по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т.п. Вторая методология ориентируется на измерения на уровне единичных микроскопических объектов - в первую очередь клеток и субклеточных частиц.

Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ . plate readers). Спектрофлуориметры - это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры - это устройства, рассчитанные на массовые анализы большого количества образцов (стандартные планшеты рассчитаны на 96, 384 или 1536 образцов). Измерения в них осуществляются по нескольким фиксированным характеристикам - например, по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области. Недавно появились планшетные флуориметры с возможностью измерения параметров затухания флуоресценции и тем самым оценки времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.

Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта. Первый основан на получении цифровых изображений флуоресцирующих микрообъектов (англ . fluorescence imaging) с последующим их компьютерным анализом (англ . computer image analysis). Второй - на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке при прохождении через узкий капилляр специального прибора - проточного цитометра (англ . flow cytometer).

Цифровые изображения флуоресцирующих микрообъектов получают с использованием флуоресцентной микроскопии, которая недавно пережила настоящую техническую революцию. Так, в частности, наряду со стандартными флуоресцентными микроскопами, существенно усовершенствованными цифровыми фотокамерами и компьютерами, разработаны принципиально новые устройства. Это прежде всего так называемые конфокальные микроскопы (рис. 8). В конфокальном микроскопе возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Путем сканирования этим «оптическим зрачком» в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, регистрации сигналов фотоумножителем и обработки компьютером получается пространственное изображение флуоресцирующего объекта. Такая конструкция прежде всего позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современные конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.

Рисунок 7. Конфокальный микроскоп.

Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует... вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Возбуждение атомов в них осуществляется светом с длиной волны больше длины волны флуоресценции... (см. раздел Флуоресценция: свечение, индуцированное светом ). На самом деле основные законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются. Просто при достаточной интенсивности светового потока с длиной волны больше длины волны возможной флуоресценции в один и тот же атом одновременно могут «попасть» два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными . Одновременное «попадание» двух фотонов в один атом - явление сравнительно маловероятное, и может происходить только там, где световой поток максимально сконцентрирован, т.е. в фокусе объектива. Это и обеспечивает высокое разрешение флуоресцентных изображений. К достоинствам, отличающим двухфотонные от других микроскопов, относится также их способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм (есть сообщения о проникновении и на большую глубину), а также возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.

Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения единичных (!) флуоресцирующих молекул.

Однако «на вершине» современной оптической микроскопии по разрешающей способности стоят так называемые «наноскопы», то есть микроскопы, позволяющие различать на изображении флуоресцирующие объекты, расстояние между которыми составляет несколько нанометров. Существует два типа таких устройств. Первый основан на сканировании образца двумя узкими пучками лазерного излучения. Оптические свойства их подобраны так, что один возбуждает флуоресценцию в «нужной» области, а другой подавляет ее в рядом лежащей «ненужной» области. Размер же «нужной» области может быть порядка нескольких нанометров. Этот метод получил название STED-микроскопия .

Принцип работы второго типа наноскопов опирается на возможность оптического «включения и выключения» флуоресценции отдельных флуорофоров. Получают изображение одного и того же образца несколько раз, включая то одни, то другие молекулы. Затем компьютер «накладывает» изображения друг на друга, и на суммарном изображении можно увидеть свечение каждой из близлежащих молекул. В «обычном», пусть даже и конфокальном, микроскопе они слились бы одно светящееся пятно. Такой подход назвали PALM-микроскопией .

Флуоресцентные «репортажи», зарегистрированные в виде цифровых изображений, «расшифровывают», то есть извлекают количественную информацию с помощью специальных компьютерных программ анализа изображений. Так можно измерять интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивать спектральные характеристики излучения (псевдоспектральный анализ), определять количество флуоресцирующих частиц (например, клеток), характеризовать временные и поляризационные параметры флуоресценции.

Следует отметить также и эстетическую информативность флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир причудливого сочетания цвета и форм (см. рис. 8). Фирмы-производители микроскопов Nikon и Olympus даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции. С галереями работ-победителей в этих конкурсах можно познакомиться на сайтах Olympus BioScapes и Nikon Small World .

Рисунок 8. Флуоресцентные микрофотографии с галереи ежегодного конкурса Nikon Small World. 1. Фибробласты мыши. 2. Веслоногий рачок Temora longicornis . 3. Митоз в клетках легких тритона. 4. Клетки глии мозжечка мыши in vivo (двухфотонная флуоресцентная микроскопия).

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Как правило, это суспензии клеток, в которых находятся флуорофоры. Сильная сторона проточных цитометров - скорость регистрации сигналов от единичных объектов. Обычный коммерчески доступный цитометр позволяет измерять флуоресцентные сигналы от клеток со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные - до 25000 клеток в секунду! Стандартный вариант работы предусматривает измерение у каждого объекта от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Измерения на большом массиве объектов позволяют получать статистически достоверные результаты при исследовании гетерогенности клеточных, в частности, микробных популяций.

Наряду с обычными проточными цитометрами существуют приборы, которые способны физически разделять (сортировать) клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции. Это открывает возможность дальнейшего изучения определенных субпопуляций с использованием других методов.

О чем «сообщают» флуоресцентные репортеры

Как уже отмечалось (см. раздел Флуоресцентные репортеры ), все флуоресцентные репортеры имеют «специализацию», т.е. способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров можно следить за ферментативным катализом . Как правило, это органические флуорофоры. Так, например, создают субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции. Это и служит «сообщением» о ходе ферментативного катализа. Другой прием - использование «профлуорофора», который становится флуоресцентным в результате взаимодействия с продуктом реакции. С помощью флуоресцентных репортеров ферментативных реакций исследуют динамику процессов, а также их локализацию в клетках, тканях, органах и т.п.

Репортеры, сформированные на основе антител, «информируют» о протекании иммунологических реакций . Они представляют собой физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами (иммуноглобулинами). В качестве флуоресцирующего компонента показана возможность использования всех известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. С помощью иммунологических флуоресцентных репортеров выявляют наличие в образцах определенных белков-антигенов, а также их локализацию. Так, например, показанные на рисунке 8 (фото 1) микрофибриллы в фибробластах мышей выявлены с помощью флуоресцентных антител.

Много видов информации можно получать с использованием ФБ. Разработаны методы создания генов гибридных белков, содержащих ФБ в качестве флуоресцирующей метки какого-нибудь естественного белка или даже нуклеиновой кислоты. Введение в клетки генов таких «гибридов» позволяет по флуоресценции определять «адреса» локализации молекулярных компонентов живых клеток , следить за динамикой их синтеза и перемещений. Существует рН-зависимость флуоресценции ФБ-содержащих гибридных белков, что используется для измерения внутриклеточного рН . Преимуществом таких рН-репортеров по сравнению с другими рН-чувствительными органическими флуорофорами является возможность измерений рН внутри различных внутриклеточных отделов (органелл), куда «адресован» основной компонент «гибрида».

Особый интерес вызывает применение различных ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на БПЭ. Для изучения взаимодействия или совместной локализации в клетках каких-нибудь двух белков к ним присоединяют два ФБ, подобранных так, чтобы при их сближении был возможен эффект БПЭ. Похожим образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках. С этой целью соответствующие ФБ присоединяют к разным участкам белковой молекулы. Появление эффекта БПЭ свидетельствует о сближении ФБ и тем самым о конформационных перестройках в исследуемом белке. На этом же принципе работает «конструкция» из трех белков, которая используется как индикатор содержания ионов Са 2+ в живых клетках . В нее входят два ФБ и Са 2+ -связывающий белок кальмодулин между ними. При связывании Са 2+ конформация кальмодулина изменяется, ФБ сближаются и дают сигнал БПЭ. Здесь уместно заметить, что для регистрации ионов Са 2+ внутри клеток существуют и «простые» органические флуоресцентные репортеры. Белковые же репортеры могут быть более точно «адресованы» в определенные внутриклеточные компоненты либо с помощью микроинъекций, либо путем включения в структуру белка с определенной внутриклеточной локализацией.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения, в котором находится молекулы флуорофоров, позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. Измерение внутриклеточной вязкости основано на зависимости поляризации флуоресценции от вращательной диффузии репортеров. Благодаря специально отобранным репортерам удалось измерить вязкость цитоплазмы внутри некоторых органелл, а также в гидрофобном слое биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на них. С помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала . Для измерения внутриклеточной температуры разработано несколько вариантов флуоресцентных репортеров на основе лантанидов, квантовых точек, термочувствительных полимеров и органических флуорофоров. Наиболее впечатляющие результаты получены от специально сконструированных органических флуорофоров, которые способны «сообщать» температуру в различных частях клеток, «зашифрованную» в динамических параметрах затухания флуоресценции.

Что нового о микромире мы узнали благодаря флуоресцентным репортерам?

Флуоресцентные репортеры долго и успешно «служат» экспериментальной биологии и медицине. Только перечисление различных вариантов их применения могло бы составить объем не одной статьи. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль в изучении принципиальных свойств и явлений биологических систем. Отметим некоторые из них для иллюстрации.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран* . Согласно этой модели, при структурной целостности и обеспечении барьера проницаемости для гидрофильных веществ биологическая мембрана достаточно «жидкая», чтобы в ней могли перемещаться «по назначению» ее отдельные компоненты. Такое представление о биологических мембранах позволяет понять основные молекулярные механизмы их функционирования, а также свойства живых клеток в целом.

* - В том числе благодаря флуоресцентным техникам было установлено, что мембрана является не просто пассивным «морем» фосфолипидов, в котором плавают «острова» мембранных белков, а полноправным участником множества важнейших биофизических процессов: « » . - Ред.

Механизмы трансформации энергии в клетках также стали понятны в значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондиральный рН*, а также разность электрический потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального донора энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитополазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

* - об устройстве флуоресцентного pH-сенсора см. статью « » . - Ред.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций. Эта координация осуществляется за счет специфического взаимодействия компонентов так называемых сигнальных систем. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только с появлением подходов, основанных на применении флуоресцентных репортеров, стало возможным получать сведения о пространственно-временной организации сигнальных путей непосредственно в клетках. Так, в частности, можно в реальном времени следить за пространственной динамикой взаимодействия белков-компонентов сигнальных систем. Это позволяет изучать распространение, усиление и интеграцию сигналов в клетках. Более того, стало возможным на уровне единичных клеток оценивать динамику экспрессии генов, что позволяет подойти к развитию концепций клеточной индивидуальности в противовес традиционным статистическим подходам. Следует отметить также и то, что с помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить неизвестные ранее сигнальные компоненты. Например, была выявлена принципиальная роль ионов Са 2+ как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине прошлого века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот - акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. В многочисленных исследованиях природных образцов постоянно обнаруживалось несоответствие между данными о содержании микроорганизмов, полученными путем учета по колониям размножающихся клеток на чашках Петри, и данными прямого подсчета микроорганизмов, прокрашенных флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот, с помощью микроскопии. Флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри. Для объяснения этих данных были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток может находиться в некотором состоянии «покоя» и не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют «потребностям» некоторой части популяции для размножения. Проверка этих гипотез показала, что обе эти возможности могут реализовываться. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направления исследований.

Первое связано с изучением так называемого «жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов». Особая значимость этого направления обусловлена наличием такого состояния у многих патогенных для человека микроорганизмов. В этом состоянии они как бы «невидимы» для стандартных методов диагностики. Кроме того, в этом состоянии у них увеличивается устойчивость к лекарственным препаратам.

Второе направление - это выявление и изучение микроорганизмов непосредственно в природных образцах (лат. in situ , буквально - на месте ) путем прямого анализа их нуклеиновых кислот без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление даже получило собственное название - метагеномика . Благодаря методам метагеномики, среди которых, кстати, некоторые основаны на использовании флуоресцентных репортеров, появилась возможность по-новому оценить биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом. Вот так «незатейливые» репортажи двух флуоресцентных репортеров способствовали появлению двух важнейших направлений исследований в современной микробиологии.

Итак, флуоресцентные репортеры сегодня представляют собой большую армию разнообразных «специалистов», которые уже имеют славную историю в экспериментальной биологии и медицине. Их флуоресцентные репортажи позволили лучше «разглядеть» те уголки микромира, куда может проникнуть свет. Причем разглядеть не только визуально, но и с точки зрения понимания физико-химических и биологических закономерностей. И все же исследователи, работающие в области разработки и применения этих «молекулярных помощников» изучения микромира, считают, что это только начало!

Видеозапись 5-го семинара Совета молодых ученых Института биоорганической химии РАН: «Технология акустической фокусировки частиц в проточной цитометрии »;

Липидный фундамент жизни ;

Нано-pH-метр ;

По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;

Пучков Е.О. (2014). Флуоресцентные репортеры и их репортажи . Химия и Жизнь № 9 (2014) , 8–13. .

Классификация электронных переходов

Диаграмма Яблонского

Физические процессы, протекающие в электронно-возбужденном состоянии молекул, принято представлять в виде диаграммы Яблонского. Основными безызлучательными процессами дезактивации нижнего возбужденного состояния S 1 являются внутренняя конверсия (переход между состояниями одинаковой мультиплетности) и интеркомбинационная конверсия (переход между состояниями разной мультиплетности, например, синглет-триплетный переход S 1 ®T 1 ). Внутренняя конверсия S 1 ®S 0 – сравнительно медленный процесс. Поэтому в возбужденном состоянии S 1 могут наблюдаться процессы спонтанного испускания фотона (спонтанное излучение) и фотохимические реакции. Излучательными процессами являются разрешенная по спину флуоресценция и запрещенная по спину фосфоресценция.

Электроны в органической молекуле располагаются на молекулярных s-, p- и n -орбиталях. На каждой молекулярной орбитали помещаются два электрона, отличающихся спинами. При возбуждении молекулы светом происходит переход электрона с занятой связывающей орбитали на свободную разрыхляющую орбиталь. Такие переходы обозначают в соответствии с их орбитальной природой: s-s*, n -s*, p-p* и n -p*.

Полосы поглощения, обусловленные переходами s®s* , находятся преимущественно в вакуумной УФ области < 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.

Переходам n -s* соответствуют полосы поглощения в УФ области. Например, органические соединения, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталях гетероатомов, О, N, S, поглощают УФ свет в области около 200 нм.

Переходам p®p* и n ®p* соответствуют полосы поглощения в средней УФ-области. При сопряжении кратных связей полосы, обусловленные этими переходами, смещаются в ближнюю УФ- и видимую область спектра. Переходы n ®p* характерны для соединений, содержащих такие хромофорные группы, как С=О, C=S, N=N; эти переходы часто оказываются запрещенными, и соответствующие им полосы поглощения имеют сравнительно низкую интенсивность.

Значительный интерес представляют электронные переходы с переносом заряда. Если в молекуле имеются электронодонорная и акцепторная группы, и они находятся в p-электронном сопряжении, то переход S 0 ®S 1 может сопровождаться переносом заряда от донора к акцептору по цепи сопряжения, как например, в данном стириловом красителе:

Федеральное агентство морского и речного транспорта РФ
МОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени адмирала Г.И. Невельского

Гуманитарный институт

Морского физико-технического института

Курсовая работа по флуоресценции

Выполнил: Демиденко А. А.,

студент 20.31 группы

Руководитель: Майор А. Ю.

Владивосток
2010
Оглавление.

Глава 1 – основы спектроскопии.

Диаграмма Яблонского.

Характеристики испускания флуоресценции.

Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения.

Правило зеркальной симметрии.

Глава 2 – Технические составляющие.

Фото - электронный умножитель.

Электронно - оптический преобразователь.

Приборы с зарядовой связью.

Металл - окисел - полупроводник (МОП-ёмкость).

Зарядовая связь.

Сдвиговый регистр с зарядовой связью.

Фоточувствительные приборы с зарядовой связью (ФПЗС).

Глава 3 – Флуориметры.

Проточный лазерный флуориметр.

Малогабаритный ЛИФ спектрометр.

Список используемой литературы.

Введение

Решение проблем окружающей среды и рационального использования природных ресурсов во многом зависит от разработки и внедрения методов дистанционного экспресс-анализа малых примесей в атмосфере и воде. В естественных водных средах такими примесями являются биологическая связь, растворенные органические и минеральные вещества, многочисленные загрязнители. Большими возможностями в анализе примесей располагает лазерная спектроскопия, использующая комбинационное рассеивание света, флуоресцентный анализ.
В настоящее время для оперативного мониторинга водных экосистем широко применяют оптические методы позволяющие определять концентрацию фитопланктона и других веществ. Наибольшее распространение получили спектральные методы. Особенно актуальными такие исследования стали после выявления прямой зависимости биологической продуктивности морей и океана от содержания в воде фитопланктона.
Определение концентрации фитопланктона по оптическим характеристикам морской среды может выполняться пассивными и активными методами. Первый широко используют с применением авиа- и спутниковых носителей. Эти методы основаны на измерении яркости отражаемой от поверхности воды солнечной энергии в широком диапазоне длин волн. Они позволяют собирать масштабные данные о поверхности водной среды, но имеют существенные ограничения: малое пространственное разрешение и невозможность измерения глубинных профилей. Использование пассивных методов ограничивается их не высокой точностью, что обусловлено сильным влиянием состояния атмосферы в месте проведения измерений.
Активные методы основаны на облучении воды лазерным лучом и регистрации спектра флуоресценции. Различают лидарные, прокачиваемые и погружные флуориметры. Самыми оптимальными являются проточные флуориметры, которые обладают высокой точностью и большим пространственным разрешением.

Глава: 1

Основы спектроскопии.

Люминесценция- испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний – делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояния. В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что эти электроны спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного сингнетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние.
Флуоресценция- это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически “разрешимы”, а типичные величины скоростей испускания для них~10 8 с -1 . Высокие значения скорости испускания приводят к временам затухания флуоресценции 10 8 с(10 нс). Время жизни- это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция- это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности, как правило из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации.
Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см -1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор рас творен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, имеют четкую структуры, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний. Другие состояния, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

1.1. Диаграмма Яблонского
Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским. Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S 0 ; S 1 ; S 2 соответственно (рис. 1.а). Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно

РИС.1.а Диаграмма Яблонского.

Рис. 1.б Диаграмма Яблонского.

Показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо-дит примерно за 10 -18 с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер(принцип Франка- Кондона).
Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена. Относительное число молекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описывается распределением Больцмана.
1.2 Характеристики испускания флуоресценции

Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из нижеперечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения.

1.3. Стоксов сдвиг

Рис. 2. Источником ультрафиолетового возбуждения служил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Перед приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином. Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невооруженным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.
Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S 1 . К тому же обычно происходит переход

РИС. 2. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.

на возбужденные колебательные уровни состояния S 0 (см. рис. 1), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры к реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.

1.4. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния S 1 . Эта релаксации происходит за время порядка 10 -12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S 2 , так и из S 1 - состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

1.5. Правило зеркальной симметрии

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из S 0 в S 1 . Это особенно наглядно в случае перилена. Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состоянии S 0 и S 1 . Для многих молекул различное распределение электронов в состояниях S 0 и S 1 , существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без изменения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис 3).

РИС. 3 Правило зеркальной симметрии и факторы Франка-Кондона

Глава: 2

Технические составляющие.

2.1-Фото Электронный Умножитель
Фотоэлектронным умножителем называют электровакуумный прибор, преобразующей энергию оптического излучения в электрические сигналы и содержащий фотокатод, вторично-электронный умножитель и анод. От вакуумного фотоэлемента ФЭУ отличается тем, что кроме фотокатода и анода содержит ещё фокусирующую электронно-оптическую систему, диафрагму и дополнительные электроды (диноды), являющиеся эмиттерами вторичных электронов. (рис. 4)
При освещении фотокатод 1 эмитирует первичные фотоэлектроны, которые ускоряются электрическим полем и фокусируются электронно-оптической системой 2 на первый динод Э 1 , вызывая его увеличенную вторичную электронную эмиссию. Вторичные электроны, вылетевшие из первого динода, ускоряются электрическим полем и направляются на второй динод Э 2 , увеличенный поток электронов со второго динода направляется на третий и т.д.
Электрическое поле, ускоряющее электроны, создаётся делителем постоянного напряжения, обеспечивающим больший положительный потенциал каждого последующего каскада относительно предыдущего R1 – R11 .
Пространство образуемое поверхностями фотокатода 1 и первого динода Э 1 с расположенными между ними электродами, котодной (входной) камерой ФЭУ Форма и распределение электрического потенциала на поверхности фотокатода фокусирующего электрода 2 и диафрагмы 3 должны обеспечить максимальный сбор фотоэлектронов на первый динод за счёт использования законов движения электронов электрическом поле. Качество электронно-оптической системы катодной камеры определяется коэффициентом сбора электронов Y k (отношением числа фотоэлектронов, достигших первого динода, к общему числу эмитированных фотокатодом электронов n k) . Коэффициент сбора электронов у современных ФЭУ близок к единице.
Первичные фотоэлектроны, попадая на первый динод, взаимодействуют с электронами его вещества и возбуждают их до более высоких энергетических состояний. Часть электронов перемещается к границе динода с вакуумом. Электроды, которые достигают поверхности с энергией, превышающей поверхностный потенциальный барьер, переходя в вакуум и ускоряются электрическим полем в направлении ко второму диноду.

Рис.4 Устройство ФЭУ со схемой его питания

2.2-Электронно Оптический Преобразователь

Рис 5
1-входное окно
2-Защитная плёнка
3- Микроканальная пластина (МКП)
4-Фосфорный экран
5-выходное окно
Принцип действия хорошо иллюстрирует рис. 5. Попадая в канал, электрон испытывает соударения со стенкой и выбивает вторичные электроны. В тянущем электрическом поле этот процесс многократно повторяется, позволяя получить коэффициент усиления Nх10 4
и т.д.................

поглощение света. Закон Бугера Ламберта, бера

Поглощение света - это явление уменьшения интенсивности света при прохождении его через вещество. Уменьшение интенсивности света происходит в результате того, что энергия света переходит в другие виды энергии: энергию активизации, ионизации молекул, энергию теплового хаотического движения частиц в веществе и др. При прохождении монохроматического света через окрашенные растворы небольшой концентрации (С? 20%) и при условии, что растворитель не поглощает данную длину волны, интенсивность света также убывает по экспоненциальному закону. Закон поглощения света для окрашенных растворов называют законом Бугера-Ламберта-Бера: I= Io* e^- чcd, где С - концентрация раствора; ч - показатель поглощения для раствора единичной концентрации, зависит от природы растворенного вещества и длины волны падающего света.

Спектральные свойства и характеристики хромофоров. Диаграмма Яблонского

Хромофор - молекула, способная поглощать свет определенного диапазона длин волн.

Так, карбонильная группа СО является хромофором, поглощающим в области 280 нм, в то же время кетоны - бесцветные вещества.

Первичными стадиями фотобиофизического процесса являются поглощение света хромофорной группой и образование электронно- возбужденных состояний (ЭВС). При поглощении света молекулы, ионы, атомы, радикалы и другие типы частиц, участвующих в химических превращениях, могут переходить в электронно-возбужденные состояния. В них происходит изменение физических и химических свойств молекул по сравнению с основным состоянием. Меняются дипольный момент, геометрия, распределение электронной плотности, кислотно-основные свойства и т. д., и молекулы в возбужденном состоянии обладают иной реакционной способностью, что проявляется не столько в изменении скорости реакции, сколько в их ином, по сравнению с основным состоянием, направлении. Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским

В основном состоянии все электроны занимают самые низшие электронные уровни и расположены на орбиталях попарно, причем их спины имеют противоположное направление (антипараллельны). Такое состояние молекулы называют синглетным невозбужденным (основным) состоянием и обозначают как S0. Так же обозначают энергетический уровень невозбужденной молекулы

При поглощении света происходит переход одного из электронов на вышележащую орбиталь, но его спин не меняется. Такое состояние молекулы и ее энергетический уровень обозначают как S1 или S2 в зависимости от того, на какой уровень перешел электрон. Это синглетное возбужденное состояние обозначают как S*. Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S0, S1, и S2 соответственно. Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние растворителя в данной схеме во внимание не принимается. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10-15 с - время, слишком короткое для заметного смещения ядер.